新冠病毒（SARS-CoV-2）感染的临床表现多样，从无症状到致命的呼吸衰竭都有。尽管在康复个体中可诱导产生功能性的新冠病毒特异性 CD8+ T 细胞反应，但病毒特异性 CD8+ T 细胞反应在控制新冠病毒复制方面的作用仍不明确。在本研究中，我们发现，在食蟹猴中，即使没有 CD8+ T 细胞，亚急性的新冠病毒复制也能得到控制。八只食蟹猴经鼻内接种了 10⁵或 10⁶半数组织培养感染剂量（TCID50）的新冠病毒，其中八只食蟹猴中的三只在感染后的第 5 天和第 7 天接受了单克隆抗 CD8 抗体治疗。在这三只食蟹猴中，从第 7 天及以后都检测不到 CD8+ T 细胞，而在其余五只未接受治疗的动物中诱导出了病毒特异性 CD8+ T 细胞反应。在所有食蟹猴中，感染后 10 至 17 天在鼻咽拭子中都检测到了病毒 RNA，并且抗 CD8 抗体治疗组和未治疗组动物的咽拭子中病毒 RNA 水平的变化情况以及血浆中和抗体滴度相当。在未治疗组的两只食蟹猴中，在第 21 天尸检时获取的咽黏膜和 / 或咽后淋巴结中检测到了新冠病毒 RNA，但在所有接受抗 CD8 抗体治疗的食蟹猴中均未检测到。CD8+ T 细胞反应可能有助于控制新冠病毒感染中的病毒网络证劵杠杆渠道，但我们的结果表明，在没有 CD8+ T 细胞的情况下，亚急性病毒复制也有可能得到控制，这意味着 CD8+ T 细胞功能障碍可能并非导致病毒控制失败的唯一原因。
展开剩余95%新冠病毒感染的临床表现范围很广，从无症状到致命的呼吸衰竭都有。病毒控制失败和 / 或致命疾病进展的决定因素尚未完全阐明。获得性免疫效应因子，即抗体和 CD8+ T 细胞，都被认为有助于病毒控制。然而，这两个方面中任何一个的缺陷是否与控制新冠病毒复制的失败直接相关仍不清楚。在本研究中，为了了解感染确立后控制病毒对 CD8+ T 细胞的需求，我们研究了在亚急性期给予单克隆抗 CD8 抗体耗竭 CD8+ 细胞对食蟹猴中新冠病毒复制的影响。出乎意料的是，我们的分析显示，耗竭 CD8+ 细胞对病毒复制没有显著影响，这表明在没有 CD8+ T 细胞的情况下，亚急性的新冠病毒复制也能得到控制。CD8+ T 细胞反应可能有助于控制新冠病毒感染中的病毒，但这项研究表明，CD8+ T 细胞功能障碍可能并非导致病毒控制失败或致命疾病进展的唯一原因。
一、引言
由严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）引起的 2019 冠状病毒病（COVID-19）已迅速传播，导致了一场重大的大流行。SARS-CoV-2 通过呼吸道传播，从感染到症状出现的平均潜伏期估计为 5 天。SARS-CoV-2 感染的临床表现范围很广，从无症状到致命的呼吸衰竭都有。多种混杂因素，如年龄和基础疾病，都与 COVID-19 的严重程度相关。例如，据报道，针对 I 型干扰素的自身抗体与危及生命的 COVID-19 肺炎有关。然而，病毒控制失败和 / 或致命疾病进展的确切决定因素尚未完全阐明。
大多数非致命的 COVID-19 病例在咽拭子中可检测到病毒产生的时间有限，在感染后大约一周达到峰值。宿主的获得性免疫反应以及先天性免疫反应都参与了病毒复制的控制。大多数受感染个体都会诱导产生抗 SARS-CoV-2 中和抗体。最近的临床研究，包括那些关于康复期血浆和 / 或单克隆抗体给药的研究，已经表明中和抗体对 SARS-CoV-2 感染的有效性。动物研究已经证实了中和抗体在体内对感染的有效性。此外，在大多数非致命的 COVID-19 病例中也会诱导产生 SARS-CoV-2 特异性 T 细胞反应。目前的研究表明，在康复的 COVID-19 个体中会诱导产生功能性的病毒特异性 CD8+ T 细胞反应，这意味着 CD8+ T 细胞对 SARS-CoV-2 复制有抑制作用。因此，获得性免疫效应因子，即抗体和 CD8+ T 细胞，都被认为有助于病毒控制。然而，这两个方面中任何一个的缺陷是否与控制 SARS-CoV-2 复制的失败直接相关仍不清楚。据报道，患有无丙种球蛋白血症的 COVID-19 患者控制住了疾病进展，这表明即使在没有抗体反应的情况下也能控制病毒。
先前一项在恒河猴再次感染前给予抗 CD8 抗体的研究表明，CD8+ T 细胞对预防 SARS-CoV-2 再次感染有部分作用。然而，在感染确立后控制病毒复制对 CD8+ T 细胞的需求仍不清楚。在本研究中，我们研究了在亚急性期给予单克隆抗 CD8 抗体耗竭 CD8+ 细胞对食蟹猴中 SARS-CoV-2 复制的影响。出乎意料的是，我们的分析显示，耗竭 CD8+ 细胞对病毒复制没有显著影响，这表明在没有 CD8+ T 细胞的情况下，亚急性的 SARS-CoV-2 复制也能得到控制。
二、结果
01. 食蟹猴经鼻内接种后 SARS-CoV-2 感染的动态变化
先前的研究表明，用 10⁵半数组织培养感染剂量（TCID50）的 SARS-CoV-2 进行鼻内和气管内接种会导致恒河猴感染，感染后一周以上在咽拭子中仍可检测到病毒 RNA。在本研究中，我们首先研究了仅鼻内接种 SARS-CoV-2 是否能导致食蟹猴感染。在第一个实验中，食蟹猴经鼻内接种了 10⁶（在食蟹猴 N011 中确切为 7.5×10⁵）、10⁵（在食蟹猴 N012 和 N013 中确切为 7.5×10⁴）或 10⁴（在食蟹猴 N014 中确切为 7.5×10³）TCID50 的 SARS-CoV-2（表 1）。食蟹猴 N011、N012 和 N013 在第 2 天，即峰值时，鼻咽拭子中的病毒 RNA 水平相似（图 1A）。在喉拭子中也检测到了病毒 RNA，峰值较低（图 1B）。在病毒接种后，鼻咽拭子中的病毒 RNA 大约可检测两周（最长：N011 中到第 17 天，N012 中到第 12 天，N013 中到第 14 天）（图 1A、1C 和 1D）。在鼻咽拭子和喉拭子中也检测到了亚基因组 RNA（sgRNA），表明病毒在复制（图 2A 和 2B）。在 N011 的鼻咽拭子中直到第 9 天、N012 中直到第 7 天、N013 中直到第 5 天都检测到了 SARS-CoV-2 sgRNA（图 2A、2C 和 2D）。然而，在接种了 10⁴ TCID50 SARS-CoV-2 的食蟹猴 N014 中，未检测到 sgRNA，并且仅在鼻咽拭子中直到第 5 天检测到了病毒 RNA，尽管水平较低（图 1A 和 2A），这表明 10⁴ TCID50 低于能持续诱导可检测到的病毒复制的病毒接种阈值。随后，N014 被排除在进一步的分析之外。
图1. 拭子中的病毒 RNA 水平。（A-D）所有动物（A、B）或感染了 10⁶（C）或 10⁵（D）TCID50 SARS-CoV-2 的动物感染 SARS-CoV-2 后，鼻咽拭子（A、C、D）和喉拭子（B）中病毒 RNA 水平的变化。检测下限约为每拭子 3×10³ 拷贝。（E）比较感染 10⁶ TCID50 和 10⁵ TCID50 SARS-CoV-2 的食蟹猴在感染后第 5 天鼻咽拭子中的病毒 RNA 水平。未观察到显著差异。（F）比较感染 10⁶或 10⁵ TCID50 SARS-CoV-2 的 N 组和 D 组动物在感染后第 5 天（左）、第 7 天（中）和第 9-12 天（右）鼻咽拭子中的病毒 RNA 水平。未观察到显著差异。
图2. 拭子中的病毒亚基因组 RNA 水平。所有动物（A、B）或感染了 10⁶（C）或 10⁵（D）TCID50 SARS-CoV-2 的动物感染 SARS-CoV-2 后，鼻咽拭子（A、C、D）和喉拭子（B）中病毒 sgRNA 水平的变化。检测下限约为每拭子 3×10³ 拷贝。
在第二个实验中，两只（N021 和 D023）和三只（N022、D024 和 D025）食蟹猴分别经鼻内接种了 10⁶和 10⁵ TCID50 的 SARS-CoV-2（表 1）。五只食蟹猴中的三只（D 组中的 D023、D024 和 D025）在第 5 天和第 7 天静脉注射了单克隆抗 CD8 抗体。与第一个实验中接种 10⁶或 10⁵ TCID50 SARS-CoV-2 的三只食蟹猴相比，第二个实验中的五只食蟹猴在第 2 天鼻咽拭子中的病毒 RNA 和 sgRNA 水平相当（图 1A 和 2A）。实际上，在第一个实验的前三只和第二个实验的后五只动物之间，第 5 天鼻咽拭子中的 RNA 水平没有显著差异（图 1E）。在接种 10⁶（n = 3）和 10⁵（n = 5）TCID50 SARS-CoV-2 的食蟹猴之间，在第 2 天和第 5 天，无论是鼻咽拭子还是喉拭子中的病毒载量都没有明显差异（图 1C、1D、2C 和 2D）。在接种后，N021 的鼻咽拭子中直到第 14 天、N022 的直到第 10 天都检测到了病毒 RNA（图 1A、1C 和 1D）。在接种后，N021 的鼻咽拭子中直到第 5 天、N022 的直到第 7 天都检测到了 SARS-CoV-2 sgRNA（图 2A、2C 和 2D）。总之，在第一个和第二个实验中，用 10⁶或 10⁵ TCID50 的 SARS-CoV-2 经鼻内接种食蟹猴会导致病毒复制，在鼻咽拭子中可检测到病毒 RNA 的时间为 10 至 17 天。
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表1. 食蟹猴实验方案。
02.CD8+ 细胞耗竭后 SARS-CoV-2 感染的动态变化
然后，我们研究了 CD8+ 细胞耗竭对 SARS-CoV-2 感染亚急性期病毒复制的影响。在第 5 天和第 7 天接受抗 CD8 抗体治疗的三只 D 组食蟹猴中，从第 7 天及以后在外周血中检测不到 CD8+ T 细胞（图 3）。与五只未治疗的 N 组食蟹猴相比，这三只食蟹猴在抗 CD8 抗体治疗前（第 5 天）和治疗后（第 7 天）鼻咽拭子中的病毒 RNA 水平相当（图 1F）。在病毒接种后，D025 的鼻咽拭子中直到第 10 天、D023 和 D024 的直到第 14 天都检测到了病毒 RNA（图 1A、1C 和 1D）。在 D023 的鼻咽拭子中直到第 2 天、D024 的直到第 5 天、D025 的直到第 7 天都检测到了病毒 sgRNA（图 2A、2C 和 2D）。总体而言，在三只接受抗 CD8 抗体治疗的 D 组食蟹猴和五只未治疗的 N 组食蟹猴之间，拭子中的病毒 RNA 水平没有明显差异。
图3. 外周血 B 细胞和 T 细胞频率。
食蟹猴感染 SARS-CoV-2 后，外周血单个核细胞（PBMC）中 CD3+%、CD3+CD4+%、CD3+CD8+% 和 CD3-CD20+ T 细胞百分比的变化。
我们还检查了是否可以从单个拭子样本中分离出病毒（表 2）。从经鼻内接种 10⁶或 10⁵ TCID50 的所有八只动物的鼻咽拭子和喉拭子中都分离出了 SARS-CoV-2。在未接受抗 CD8 抗体治疗的食蟹猴中，病毒分离持续 2 至 12 天（N021 中直到第 2 天，N013 和 N022 中直到第 5 天，N011 中直到第 7 天，N012 中直到第 12 天），在接受抗 CD8 抗体治疗的食蟹猴中持续 2 至 7 天（D024 中直到第 2 天，D023 和 D025 中直到第 7 天）。没有迹象表明 CD8 细胞耗竭后病毒分离增加。
表2. SARS-CoV-2 感染后从咽拭子中分离病毒。
食蟹猴 N021 在感染后第 14 天安乐死，而其余动物在感染后第 21 天安乐死（表 1）。对体温的检查显示，一些动物出现了短暂的低热（N021 和 D025 中在第 2 天；D023 和 D024 中在第 6 天；N012 中在第 13 至 19 天）（图 S1）。对食蟹猴 N021 在第 14 天尸检时获取的肺进行组织病理学分析，发现有轻度或中度的肺部炎症（图 S2），而在第 21 天对其他动物的肺进行检查时未检测到明显的病理变化。
图S1. 猕猴感染前后的体温变化。
图S2. 食蟹猴 N021 的肺部组织病理学。从食蟹猴 N021 在感染后第 14 天尸检时获取的肺部进行苏木精和伊红染色（H&E）的代表性组织病理学图像，显示轻度或中度肺部炎症。在血管和细支气管周围观察到单核细胞浸润（左上角图）。在肺泡中观察到淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞（右上角和下图）。
从尸检时获取的咽黏膜、咽后淋巴结（RPLN）、肺、肠道和脾脏中提取 RNA，并进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）以检测病毒 RNA（表 3）。在食蟹猴 N012、N014、N021、D023 和 D024 的组织中未检测到病毒 RNA。然而，在 N011 的 RPLN 中、N013 的咽黏膜、RPLN 和脾脏中以及 N022 和 D025 的脾脏中检测到了病毒 RNA。此外，在 N013 的咽黏膜、RPLN 和脾脏中也检测到了病毒 sgRNA。没有证据表明接受抗 CD8 抗体治疗的食蟹猴中病毒复制增强。
表3. 尸检获取组织中病毒 RNA 的检测。
03.食蟹猴经鼻内接种 SARS-CoV-2 后的抗体和 T 细胞反应
所有食蟹猴在经鼻内接种 SARS-CoV-2 后都诱导产生了抗 SARS-CoV-2 中和抗体（NAb）反应（图 4）。仅在食蟹猴 N021 和 D025 中在第 7 天检测到了 NAb 反应，而在第 14 天在所有动物中都检测到了。食蟹猴 D025 和 D024 分别表现出最高和最低的 NAb 滴度。在三只接受抗 CD8 抗体治疗的食蟹猴和五只未治疗的食蟹猴之间，NAb 反应没有明显差异。
图4. SARS-CoV-2 特异性中和抗体反应：所有动物（左）或感染了 10⁶（中）或 10⁵（右）TCID50 SARS-CoV-2 的动物感染后血浆中抗 SARS-CoV-2 中和抗体滴度的变化。
最后，我们检查了五只接种了 10⁶或 10⁵ TCID50 SARS-CoV-2 且未接受抗 CD8 抗体治疗的食蟹猴中针对 SARS-CoV-2 刺突（S）、核衣壳（N）以及膜和包膜（M&E）抗原的 CD8+ T 细胞反应。在用外周血单个核细胞（PBMC）进行的分析中，在食蟹猴 N013 中未检测到 SARS-CoV-2 特异性 CD8+ T 细胞反应，但在其余四只食蟹猴中检测到了（图 5A 和 5B）。食蟹猴 N022 在第 7 天表现出 CD8+ T 细胞反应，而其余三只食蟹猴（N011、N012 和 N021）在第 14 天首次出现 SARS-CoV-2 特异性反应。对尸检时获取的下颌下淋巴结（SMLN）进行分析发现，在食蟹猴 N011、N013 和 N021 中存在 SARS-CoV-2 特异性 CD8+ T 细胞反应（图 5C）。有趣的是，在食蟹猴 N013 的 PBMC 中未检测到 SARS-CoV-2 特异性 CD8+ T 细胞反应，但在 SMLN 中检测到了。因此，在五只接种了 10⁶或 10⁵ TCID50 SARS-CoV-2 且未接受抗 CD8 抗体治疗的 N 组食蟹猴中都检测到了 SARS-CoV-2 特异性 CD8+ T 细胞反应。最后，在对接受抗 CD8 抗体治疗的食蟹猴尸检时获取的 SMLN 中证实了 CD8+ T 细胞耗竭（图 S3）。
图5. SARS-CoV-2 特异性 CD8+ T 细胞反应：（A）食蟹猴 N012 在感染后第 14 天用重叠的 M&E 肽库刺激后检测 γ 干扰素（IFN-γ）诱导的代表性设门方案。（B）感染 10⁶（中）或 10⁵（右）TCID50 SARS-CoV-2 的 N 组动物在感染后第 7 天、第 14 天和第 21 天 PBMC 中针对 S、N 和 M&E 的 CD8+ T 细胞频率。（C）在食蟹猴 N011、N013、N021 和 N022 尸检时获取的下颌下淋巴结中针对 S、N 和 M&E 的 CD8+ T 细胞频率。食蟹猴 N012 没有样本可用于分析。
图S3. 尸检时下颌下淋巴结中 CD8+ T 细胞频率。显示了尸检时获取的下颌下淋巴结中 CD3+CD8 + 细胞的频率。
三、讨论
据报道，宿主的 T 细胞和 B 细胞反应有助于控制 SARS-CoV-2 的复制。在一种感染了适应小鼠的 SARS-CoV 毒株的小鼠模型中，耗竭 CD4+ T 细胞会导致中和抗体反应减弱，以及病毒从肺部清除的时间延迟。此外，在没有 CD4+ T 细胞和 B 细胞的情况下，SARS-CoV 的复制得到了控制，这表明 CD8+ T 细胞在病毒控制中发挥作用。最近对人类的研究表明，在康复的 COVID-19 个体中会诱导产生功能性的病毒特异性 CD8+ T 细胞反应。这些报告表明 CD8+ T 细胞在控制 SARS-CoV-2 复制方面有一定作用。然而，在没有 CD8+ T 细胞的情况下，SARS-CoV-2 的复制是否能得到控制仍不清楚。在本研究中，我们研究了在病毒感染确立后的亚急性期，通过给予抗 CD8 抗体耗竭 CD8+ 细胞（包括 CD8+ T 细胞）对 SARS-CoV-2 复制的影响。我们关于病毒 RNA 以及从咽拭子中分离病毒的结果（图 2 和表 2）表明，当动物接受抗 CD8 抗体治疗时，病毒复制并未受到抑制，而在 CD8+ 细胞耗竭后，病毒复制得到了控制。我们发现，在 CD8+ 细胞耗竭后，病毒复制没有显著增强，病毒清除也没有延迟，这表明在没有 CD8+ T 细胞的情况下，亚急性的 SARS-CoV-2 复制也能得到控制。
我们的发现并不否认 CD8+ T 细胞在控制 SARS-CoV-2 复制方面的作用，也不否认疫苗诱导的 CD8+ T 细胞对病毒的保护作用。在本研究中，病毒特异性 CD8+ T 细胞反应在感染后第 1 周大多检测不到，而在第 2 周可以检测到，这与最近一篇关于 COVID-19 患者发病后急性期 T 细胞反应的报告一致。因此，CD8+ T 细胞反应在控制病毒载量峰值方面可能并不起核心作用，但在初次 SARS-CoV-2 感染后，对控制病毒复制和 / 或疾病进展可能有很大影响。有研究表明 CD8+ T 细胞反应对预防再次感染有作用，这意味着疫苗诱导的 CD8+ T 细胞反应可能会在急性期增强对病毒的控制。本研究表明，CD8+ T 细胞功能障碍与病毒控制失败没有直接关联，这可能意味着宿主可能存在多种免疫机制参与控制初次 SARS-CoV-2 的复制。
用于分析发病机制和传播以及评估疫苗和抗病毒药物的 SARS-CoV-2 感染动物模型是必要的。非人类灵长类动物模型因其在遗传和生理上与人类相似，被认为是最具临床相关性的。最近的研究表明，恒河猴和食蟹猴可以感染 SARS-CoV-2，并表现出类似于人类 COVID-19 的临床表现。这两种猕猴都呈现出轻度至中度的 COVID-19 症状，这在大多数人类中也能观察到。因此，我们使用食蟹猴的 SARS-CoV-2 感染模型来分析 CD8+ 细胞耗竭对病毒复制的影响。
我们仅尝试通过鼻内途径接种 SARS-CoV-2，而没有进行气管内接种，因为这可能更接近人类的病毒传播方式。鼻咽拭子中病毒 RNA 峰值（第 2 天）的几何平均值为每拭子 2.7×10⁸（范围：1.1×10⁸至 5.2×10⁸）拷贝，sgRNA 峰值的几何平均值为每拭子 1.0×10⁶（范围：1.8×10⁵至 1.8×10⁶）拷贝，这与用 10⁵ TCID50 的 SARS-CoV-2 进行鼻内和气管内接种的恒河猴中的情况相当。在用 10⁵ TCID50（1.4×10⁸ RNA 拷贝）的 SARS-CoV-2 接种的猕猴中，第 2 天鼻咽拭子中的病毒 RNA 拷贝数与接种物中的总病毒 RNA 拷贝数相当（N012）或更高（N013、N022、D024 和 D025），这证实了即使接种 10⁵ TCID50 的病毒，猕猴体内也会发生病毒复制。与五只接种 10⁵ TCID50 的猕猴相比，三只接种 10⁶ TCID50 的猕猴在第 2 天和第 5 天鼻咽拭子中的病毒 RNA 水平相似。所有八只经鼻内接种 10⁶或 10⁵ TCID50 SARS-CoV-2 的猕猴都产生了有效的抗 SARS-CoV-2 中和抗体反应，并且五只未接受抗 CD8 抗体治疗的猕猴诱导产生了 SARS-CoV-2 特异性 CD8+ T 细胞反应。综上所述，我们的结果表明，用 10⁶或 10⁵ TCID50 的 SARS-CoV-2 经鼻内接种食蟹猴会导致咽黏膜中的病毒复制。控制咽黏膜中的病毒复制对于控制病毒的进一步传播以及疾病进展都很重要。
我们的食蟹猴仅经鼻内接种 SARS-CoV-2（而非气管内接种）的模型被认为代表了无症状或轻度的 COVID-19。然而，对肺部的组织病理学分析在一只动物（N021）感染后第 14 天检测到了肺部炎症（图 S2），这表明经鼻内接种 SARS-CoV-2 有引发中度肺部疾病的可能性。其他动物可能在第 14 天也出现了轻度的肺部炎症，到第 21 天时炎症得到了缓解。食蟹猴 N013 表现出一种独特的表型，在第 14 天后拭子中检测不到病毒 RNA（图 1D），但在感染后第 21 天咽黏膜和下颌下淋巴结中的病毒 RNA 水平相对较高（表 3）。在第 21 天，在 PBMC 中检测不到病毒特异性 CD8+ T 细胞反应，但在下颌下淋巴结中可以有效地检测到（图 5），这表明咽黏膜中存在局部的病毒复制。
本研究使用的样本量相对有限（三只接受抗 CD8 抗体治疗的动物和五只未治疗的对照动物）。然而，这三只动物在接受抗 CD8 抗体治疗前咽拭子中的病毒载量水平相似，并且在 CD8+ 细胞耗竭后病毒载量水平也相似。既没有观察到病毒复制增强，也没有观察到病毒控制延迟。对于五只未接受抗 CD8 抗体治疗的猕猴，虽然这些反应的强度和动力学不同，但在所有猕猴中都检测到了 SARS-CoV-2 特异性 CD8+ T 细胞反应。因此，本研究为我们的结论提供了足够的证据。
总之，本研究表明，在初次 SARS-CoV-2 感染中，即使没有 CD8+ T 细胞，亚急性的病毒复制也能得到控制。CD8+ T 细胞反应可能有助于控制 SARS-CoV-2 感染，但我们的结果表明，CD8+ T 细胞功能障碍并不会单独导致病毒控制失败或疾病进展。
四、材料与方法
01. 伦理声明
动物实验在国家传染病研究所（NIID）进行，在该研究所的动物实验伦理委员会批准后（批准编号：520001），按照日本学术会议制定的《动物实验规范行为指南》中的动物实验指南开展。这些实验符合《关于在研究中使用非人类灵长类动物的韦瑟罗尔报告》的建议。每只猕猴都单独饲养在一个笼子里，每天接受标准的灵长类动物饲料和新鲜水果。病毒接种、采血、鼻咽和喉拭子采集以及抗 CD8 抗体治疗均在氯胺酮麻醉下进行。猕猴在感染后第 14 天或第 21 天在深度麻醉下通过采集全血进行安乐死。
02. 动物实验
SARS-CoV-2 wk-521 毒株在 Vero E6/TMPRSS2 细胞中进行培养扩增，并收获以制备病毒接种物储备液。通过检测 Vero E6/TMPRSS2 细胞上的细胞病变效应（CPE）和测定终点滴度来评估病毒感染性。九只食蟹猴（猕猴属，3 至 6 岁）经鼻内接种相同储备液的 SARS-CoV-2 wk-521，接种剂量为 10⁶（确切为 7.5×10⁵）TCID50（1.4×10⁹ RNA 拷贝）（n = 3）、10⁵（确切为 7.5×10⁴）TCID50（n = 5）或 10⁴（确切为 7.5×10³）TCID50（n = 1）（表 1）。九只猕猴中的三只（D 组）在感染后的第 5 天和第 7 天静脉注射每千克体重 5 毫克的抗 CD8α 抗体克隆 MT807。在病毒接种前至少五天，在氯胺酮麻醉下将一个小型可植入式温度记录仪（DST micro-T；Star-Oddi）植入腹腔内来测量体温。猕猴在感染后第 14 天或第 21 天进行安乐死并进行尸检（表 1）。
03. SARS-CoV-2 RNA 的检测
使用 QIAamp 病毒 RNA 微型提取试剂盒（QIAGEN）从 0.2 毫升的拭子溶液（1 毫升含 2% 胎牛血清 [Cytiva] 的 DMEM 培养基）中提取拭子 RNA，并使用 QuantiTect 探针逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂盒（Qiagen）和 QuantStudio 5（赛默飞世尔科技）进行实时 RT-PCR 以定量病毒 RNA。拭子 RNA 也使用以下引物进行实时 RT-PCR 以测量病毒亚基因组 RNA（sgRNA）水平 ：SARS2-LeaderF60（5’-CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCT-3’）、SARS2-N28354R（5’-TCTGAGGGTCCACCAAACGT-3’）和 SARS2-N28313Fam（FAM-TCAGCGAAATGCACCCCGCA-TAMRA）。组织 RNA 通过使用 TRIzol Plus RNA 纯化试剂盒（赛默飞世尔科技）从匀浆组织中提取，并进行酚 - 氯仿抽提，然后进行实时 RT-PCR 以检测病毒 RNA。
04. 从拭子中分离病毒
将 10 倍系列稀释的拭子溶液添加到 96 孔板中的 Vero E6/TMPRSS2 细胞中，并在不更换培养基的情况下培养 4 天。通过检测细胞病变效应（CPE）和测定终点滴度来评估病毒的分离情况。病毒滴度大于每拭子 1×10² TCID50 的拭子样本被视为阳性。
05. 抗 SARS-CoV-2 中和抗体（NAb）反应的分析
将血浆样本在 56°C 下热灭活 30 分钟。对热灭活后的血浆进行系列两倍稀释，并进行四份平行检测。在每份用于四份平行检测的混合物中，将 40 微升稀释后的血浆与 40 微升 80 TCID50 的 SARS-CoV-2 wk-521 一起孵育。在室温下孵育 45 分钟后，将 20 微升该混合物添加到 96 孔板的四个孔中（每孔 1×10⁴个 Vero 细胞）。三天后，通过检测细胞病变效应（CPE）来评估病毒感染性，以确定终点滴度。检测下限为 1:10。
06. 细胞表面标志物的分析
将全血样本用溶血溶液（BD）处理，并使用抗 CD3 APC-Cy7（SP34-2；BD）、抗 CD4 FITC（M-T477；BD）、抗 CD8 PerCP（SK1；BD）和抗 CD20 PE（2H7；BD）抗体进行表面染色。或者，对接受抗 CD8 抗体治疗的动物的全血样本用抗 CD3 APC-Cy7、抗 CD4 PerCP（L200；BD）、抗 CD8 FITC（DK25；富士胶片）和抗 CD20 PE 进行染色。用 BD FACS Canto II 分析染色后的细胞。
07. SARS-CoV-2 抗原特异性 CD8+ T 细胞反应的分析
如前所述，通过对特定刺激后 γ 干扰素（IFN-γ）诱导的流式细胞术分析来测量病毒特异性 CD8+ T 细胞频率。使用 Ficoll-Paque PLUS（Cytiva）通过密度梯度离心从全血中制备外周血单个核细胞（PBMC）。使用 Ficoll-Paque PLUS 通过密度梯度离心从切碎的淋巴结中制备淋巴结来源的淋巴细胞。在存在高尔基体阻断剂（莫能菌素，BD）、1 微克 / 毫升的抗 CD28（CD28.2，BD）和 1 微克 / 毫升的抗 CD49d（9F10，BD）的情况下，将细胞与肽库（每种肽的最终浓度大于 0.1 微摩尔）一起脉冲处理并共培养 6 小时，肽库使用跨越 SARS-CoV-2 的 S、N、M 和 E 氨基酸序列的重叠肽组（PM-WCPV-S-1、PM-WCPV-NCAP-1、PM-WCPV-VME-1 和 PM-WCPV-VEMP-1）。使用 CytofixCytoperm 试剂盒（BD）以及抗 CD3 APC-Cy7、抗 CD4 FITC、抗 CD8 PerCP 和抗 IFN-γ PE（4S.B3；BioLegend）进行细胞内 IFN-γ 染色。用 BD FACS Lyric 分析染色后的细胞。流式细胞术分析的代表性设门方案如图 5A 所示。通过从肽特异性刺激后的 IFN-γ+ T 细胞频率中减去非特异性 IFN-γ+ T 细胞频率来计算特异性 T 细胞频率。特异性 T 细胞频率小于 CD8+ T 细胞的 0.03% 被视为阴性。
08. 统计分析
使用 Prism 软件进行统计分析，显著性设定为 p 值小于 0.05。通过曼 - 惠特尼 U 检验进行比较。
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